R& D Systems位于细胞生物学行业领先地位，2009年NATURE系列刊物就有790篇论文使用R&D Systems的产品。高质量的IHC抗体不仅提供低背景高信号的染色结果，而且可以反映组织生理学的真实结果。R& D Systems抗体交叉反应低，特异性高，保证了真实可靠的信号结果。
1. R&D Systems一抗的质量如何？
为保障实验结果的可靠性，使用低交叉反应的高品质抗体。RD抗体主要采用活性重组蛋白作为免疫原，而不是人工合成的多肽。IHC/ICC抗体经过实验多重筛选及不同组织测试，避免了由于抗体的品质问题而导致的科研人员时间与样本的浪费，保证了真实可靠的信号结果。
2. R&D Systems一抗IHC应用区分石蜡和冰冻切片吗？区分IHC和ICC吗？
R& D Systems抗体经过不同的细胞及组织材料的筛选，能特异性识别石蜡和冰冻切片中的抗原，IHC和ICC相互通用。
3.做IHC/ICC, 选择单抗还是多抗？
单抗和多抗的固有特性决定了其优劣势。单抗，由单个B细胞克隆产生的，具有高亲和力和针对单个抗原表位的特异性。如需检测具有相同氨基酸序列的蛋白家族，单抗就非常适合。单抗和抗原结合的效果取决于抗原能否保持其天然构象。但是抗原的构象一旦由于各种原因发生改变，如由于蛋白相互作用，翻译后修饰，温度，pH，固定，盐浓度等，单抗和抗原结合的效果会受到严重影响。
由于多抗可以识别多个表位，不太受蛋白质构象变化的影响。一般来说，在一定的pH值和盐浓度范围内，多抗也比单抗更加稳定。基于这些原因，多抗比单抗更适合IHC/ICC实验。与其他公司多抗不同，R& D Systems有一类经抗原亲和纯化的多抗（货号以AF开头），该多抗通过抗原亲和柱的纯化提高了特异性，更加适合IHC/ICC实验。
4.一抗试剂的孵育条件？一抗浓度，温度，时间？
一抗抗体浓度，稀释，孵育时间和温度都会影响染色质量。这些变量需要针对不同抗体和样品进行优化，以达到高特异性，低背景的信号。一般的优化过程是，保持固定的孵育时间和温度，同时改变抗体的浓度以决定最佳的低噪音背景的信号。例如，使用一只高亲特异性抗体，可以使用相对较高的抗体浓度配套较短的孵育时间；或者，相对较低的抗体浓度配套较长的孵育时间。 为促进特异性染色，常选用较长的孵育时间及较低温度下进行（如室温和4°C）。
R＆D Systems的染色优化方案: 对于组织切片，起始优化条件是4°C孵育过夜; 对于染色细胞，起始优化条件是室温孵育1小时。经抗原亲和纯化的多抗 (1.7-15 ug/mL) 较单抗(5-25 ug/mL)的工作液浓度低。如使用不同浓度的同一抗体比较样本的染色效果，孵育时间和温度一定要一致。在实验室中使用新抗体时，建议进行预实验测试教广的抗体浓度。
一抗孵育的起始优化条件
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样本
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抗体
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单抗
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多抗
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组织
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5-25 ug/mL，4°C孵育过夜
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1.7-15 ug/mL，4°C孵育过夜
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细胞
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5-25 ug/mL，室温孵育1小时
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1.7-15 ug/mL，室温孵育1小时
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优势
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单抗原表位特异性
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工作浓度低
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劣势
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易受抗原表位的变化影响
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非特异性高，需经过抗原亲和纯化
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5.做石蜡切片IHC，推荐什么抗原修复技术?
背景知识：日常工作中所使用的10％福尔马林固定的石蜡包埋组织，经常产生蛋白交联反应遮蔽了组织内某些蛋白抗原，阻碍了抗原与抗体的结合。为了打开蛋白间的交联，使被封闭的抗原充分暴露，抗原修复技术在免疫组化操作过程中是个极其重要的环节，不同抗原修复方法直接影响免疫组织化学染色结果的表达。
R&D Systems建议客户采用热修复的方法，并提供了高度优化的抗原修复试剂，有效修复抗原并提高免疫反应的效果：碱性抗原修复液(Catalog # CTS013), 酸性抗原修复液 (Catalog # CTS014) ，中性pH 7.0抗原修复液(Catalog # CTS015) ，含有前3种修复液的综合修复液 (Catalog # CTS016)。在R&D Systems的实验室中, 我们发现使用碱性抗原修复 (Catalog # CTS013)容易取得良好的修复效果。
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抗原未修复
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抗原修复后
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人小脑组织Neuroplastin 65
一抗：3 μg/mL goat anti-human/mouse Neuroplastin 65 polyclonal antibody ：Catalog # AF5360
抗原修复：Antigen Retrieval Reagent-Basic (Catalog # CTS013).
染色：Anti-Goat HRP-DAB Cell & Tissue Staining Kit (brown, Catalog # CTS008) and counterstained with hematoxylin (blue).
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6.如何做对照?
合适的对照对解释IHC/ICC的结果的真实性是至关重要的。一个令人满意的IHC/ICC实验设计会有力显示抗原位于正确的特定组织，细胞类型，或亚细胞位置。我们推荐：Endogenous Tissue Background Control，No Primary Antibody Control，Isotype Control，Absorption Control，Tissue Type Control。
7.做IHC，如何避免非特异性染色？如何选择染色试剂盒？
所有IHC/ICC研究具体取决于抗体抗原结合，由疏水作用，离子相互作用，氢键结合以及其他分子间作用力等控制。然而，同样的引力也可能导致非特异性染色，即一抗结合了抗原表位以外的氨基酸。这是在IHC/ICC中是一个常见的问题。我们面临的挑战是减少非特异性相互作用，而不影响抗体的抗原表位结合。
非特异性染色的原因包括一抗和二抗与和血清蛋白的相互作用，抗体和组织间的离子相互作用，能影响IHC检测系统的内源性分子的相互作用。这些问题可能导致高背景从而无法观察到目标蛋白的表达位置。通过使用阻断剂(a blocking reagent)，可以修正非特异性染色体，而这些修正步骤都必须在一抗孵育之前完成。
封闭效果比较：
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内源性过氧化酶的影响
A. 未灭活内源性过氧化酶 B. 使用过氧化酶灭活试剂处理15分钟
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石蜡包埋的人扁桃体组织CD14
A.未经动物血清封闭 使用动物血清室温封闭15分钟
实验试剂：抗人CD14生物素化亲和纯化多抗（货号：BAF383，Sheep IgG），碱性抗原修复液(货号：CTS013)，R&D Systems®高敏染色试剂盒（CTS019，Sheep Kit）
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R&D Systems® 高敏IHC染色试剂盒（Cell and Tissue Staining Kit）是基于LSAB原理的高度优化试剂盒。高敏IHC染色试剂盒在原料上选用高特异性生物素二抗，高灵敏链酶亲和素链接酶（HS Streptavidin-HRP)。高灵敏链酶亲和素链接酶（HS Streptavidin-HRP)不与磷脂，核酸，及糖类结合蛋白结合，只与生物素化二抗节后，降低实验背景；染色试剂盒提供的4种封闭试剂（过氧化酶, 亲和素,生物素, 血清）能有效预防非特异性染色。
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Molecule
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Species
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Description
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Cat. Number
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Size
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HRP-AEC
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Goat
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Anti-Goat HRP-AEC Cell and Tissue Staining Kit
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CTS009
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50 Tests
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HRP-DAB
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Goat
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Anti-Goat HRP-DAB Cell and Tissue Staining Kit
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CTS008
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50 Tests
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HRP-AEC
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Mouse
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Anti-Mouse HRP-AEC Cell and Tissue Staining Kit
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CTS003
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50 Tests
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HRP-DAB
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Mouse
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Anti-Mouse HRP-DAB Cell and Tissue Staining Kit
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CTS002
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50 Tests
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HRP-AEC
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Rabbit
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Anti-Rabbit HRP-AEC Cell and Tissue Staining Kit
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CTS006
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50 Tests
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HRP-DAB
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Rabbit
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Anti-Rabbit HRP-DAB Cell and Tissue Staining Kit
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CTS005
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50 Tests
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HRP-AEC
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Rat
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Anti-Rat HRP-AEC Cell and Tissue Staining Kit
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CTS018
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50 Tests
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HRP-DAB
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Rat
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Anti-Rat HRP-DAB Cell and Tissue Staining Kit
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CTS017
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50 Tests
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HRP-DAB
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Sheep
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Anti-Sheep HRP-DAB Cell and Tissue Staining Kit
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CTS019
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50 Tests
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HRP-DAB
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Sheep
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Anti-Sheep HRP-DAB Cell and Tissue Staining Kit
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CTS020
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50 Tests
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优点
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即开即用
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高检测灵敏度
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适合冰冻切片，石蜡包埋切片，悬浮细胞等，
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适合细胞涂片(cytospin)(如淋巴细胞，单核细胞，转染细胞)
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适合多种一抗，如goat, mouse, rabbit, rat, sheep IgG.
组分
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4种封闭试剂（过氧化酶, 亲和素,生物素, 血清）
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高特异性生物素二抗
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高灵敏链酶亲和素HRP（HS Streptavidin-HRP)
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DAB (褐色) or AEC (红色) 染料和缓冲液
8.做ICC，如何选择荧光二抗？
NorthernLights荧光抗体耐光漂白，明亮，是多色荧光显微的理想选择。他们的光谱接近几个常用的荧光染料，可与普通过滤器设备或激光器配套使用（见下表）。
优点
- 明亮、不易褪色
- 特异信号强
- 在酒精和二甲苯中稳定
- 应用于荧光显微镜(ICC)、免疫组化(IHC) 、流式细胞仪(Flow Cytometry) 等。
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NorthernLights Secondary Reagents
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Cat. #
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Abs/Em Maxima
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Laser (Ex)
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Fluorochromes with Comparable Spectrums (Abs/Em)
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NL-493 anti-Sheep IgG
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NL012
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493/514
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Argon (488)
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FITC (492/520)
Cy™2 (489/506)
Alexa Fluor® 488 (494/519)
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NL-493 anti-Rabbit IgG
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NL006
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NL-493 anti-Mouse IgG
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NL009
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NL-493 anti-Rat IgG
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NL015
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NL-493 anti-Goat IgG
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NL003
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NL-493 Streptavidin
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NL997
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NL-493 anti-Chicken IgY
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NL018
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NL-557 anti-Sheep IgG
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NL010
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557/574
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Krypton (568)
HeNe (543)
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Phycoerythrin (565/575)
Rhodamine Red™ X (570/590)
Cy™3 (548/562)
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NL-557 anti-Rabbit IgG
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NL004
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NL-557 anti-Mouse IgG
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NL007
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NL-557 anti-Rat IgG
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NL013
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NL-557 anti-Goat IgG
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NL001
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NL-557 Streptavidin
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NL999
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NL-557 anti-Chicken IgY
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NL016
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NL-637 anti-Sheep IgG
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NL011
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637/658
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HeNe (633)
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Allophycocyanin (645-660)
Alexa Fluor® 647 (650-668)
Cy™5 (650/670)
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NL-637 anti-Rabbit IgG
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NL005
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NL-637 anti-Mouse IgG
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NL008
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NL-637 anti-Rat IgG
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NL014
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NL-637 anti-Goat IgG
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NL002
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NL-637 Streptavidin
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NL998
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NL-637 anti-Chicken IgY
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NL017
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